次氯酸鈣大(dà)腸杆菌(jūn)殺滅率(shuài)檢測技術(shù)規範與方法優化(huà)研(yán)究

一，檢測(cè)原理與標準依(yī)據

（一）殺菌機(jī)製

次(cì)氯(lǜ)酸(suān)鈣(gài)溶(róng)於水(shuǐ)釋(shì)放次氯(lǜ)酸(suān)（HClO），通過(guò)以(yǐ)下(xià)途(tú)徑(jìng)殺滅大腸(cháng)杆菌(jūn)（Escherichia coli 8099）：

1.細(xì)胞(bāo)膜破(pò)壞：HClO穿透細胞壁，氧化(huà)磷(lín)脂(zhī)雙分(fēn)子(zǐ)層；

2.蛋白質(zhì)變性：與酶(méi)活性(xìng)中心巰基(jī)（-SH）反應(yīng)，抑製代(dài)謝酶(méi)活(huó)性；

3.DNA損傷：破壞核酸(suān)結構，阻(zǔ)止細胞(bāo)復製1。

（二）標(biāo)準方法

國標：GB/T 27952-2020《消(xiāo)毒劑(jì)衛(wèi)生要(yào)求(qiú)》懸液(yè)定(dìng)量(liáng)殺滅試驗；

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：EN 1276《化學消毒(dú)劑(jì)和防腐劑 食(shí)品，工(gōng)業，家庭和公共區域(yù)用(yòng)化(huà)學消毒(dú)劑殺菌活(huó)性(xìng)評價》2。

二，試驗材料(liào)與試(shì)劑配(pèi)製(zhì)

（一）菌株與培養基

1.標準菌株：大(dà)腸(cháng)杆菌(jūn)8099（CMCC(B) 44102），由中國(guó)普通微(wēi)生物(wù)菌(jūn)種保藏(cáng)中心(xīn)提供；

2.培養基(jī)：營養瓊脂(zhī)（NA），pH 7.0±0.2，121℃滅菌20分鐘(zhōng)1。

（二）關鍵試(shì)劑

次(cì)氯(lǜ)酸鈣溶液：

母液(yè)：稱取(qǔ)0.5 g次(cì)氯(lǜ)酸鈣(gài)（有(yǒu)效(xiào)氯(lǜ)65%），用(yòng)無(wú)菌(jūn)水(shuǐ)溶解定容(róng)至(zhì)100 mL，有(yǒu)效(xiào)氯濃度3250 mg/L；

工作液(yè)：用(yòng)PBS稀(xī)釋(shì)至500 mg/L（按(àn)殺滅(miè)要求調整(zhěng)）3。

中和(hé)劑：

0.1%硫代liu酸鈉（Na₂S₂O₃）溶液(yè)，中(zhōng)和有(yǒu)效氯至＜0.1 mg/L1。

三，試驗(yàn)流(liú)程與(yǔ)操(cāo)作規範

（一(yī)）菌懸液製備

活(huó)化培(péi)養(yǎng)：

將凍(dòng)幹菌種接種至NA斜(xié)麵(miàn)，37℃培(péi)養18-24小時(shí)；

挑取單菌落(là)轉(zhuǎn)接至營養(yǎng)肉(ròu)湯，37℃振(zhèn)蕩培養6小時（對(duì)數生長期(qī)）。

稀(xī)釋與(yǔ)幹擾物(wù)添加：

用0.03 mol/L PBS（含10%小牛血清）稀釋菌(jūn)液至(zhì)1×10⁸ CFU/mL；

混匀後備用(yòng)，2小時內使(shǐ)用2。

（二）殺滅試驗步驟

樣(yàng)品處理(lǐ)：

取5 mL次(cì)氯酸鈣工作(zuò)液(yè)（500 mg/L）至(zhì)滅菌試管，37℃水(shuǐ)浴(yù)預熱(rè)5分(fēn)鐘(zhōng)；

加(jiā)入(rù)5 mL菌懸(xuán)液（1×10⁸ CFU/mL），立(lì)即計時並混匀。

作用(yòng)與(yǔ)終止：

20℃±1℃避光作用10分鐘（按(àn)產(chǎn)品(pǐn)說(shuō)明(míng)書調(tiáo)整作用時間）；

取(qǔ)1.0 mL混合液(yè)至(zhì)9.0 mL中和(hé)劑，混匀後靜(jìng)置10分鐘1。

培養(yǎng)與計(jì)數：

取中和(hé)後液體1.0 mL，用PBS梯度稀釋（10⁻¹-10⁻³）；

各稀釋度取(qǔ)0.5 mL傾(qīng)注NA平(píng)板(bǎn)，37℃培養48小時(shí)，計數(shù)菌落(là)數（CFU）2。

（三）對照組設置

對(duì)照組類(lèi)型(xíng)操(cāo)作(zuò)步驟(zhòu)作用(yòng)

陽性(xìng)對照組(zǔ)菌(jūn)懸(xuán)液(yè)+PBS（不(bù)加消毒(dú)劑(jì)）驗證(zhèng)菌(jūn)活性(xìng)

陰性對照(zhào)組(zǔ)中(zhōng)和(hé)劑+培(péi)養(yǎng)基驗(yàn)證無(wú)菌操作

中(zhōng)和劑對(duì)照組消毒劑+中和(hé)劑+菌(jūn)懸(xuán)液驗(yàn)證中和劑(jì)有效性(xìng)

四(sì)，結(jié)果計(jì)算與(yǔ)判(pàn)定標(biāo)準(zhǔn)

（一）殺(shā)滅率(shuài)計算

殺(shā)滅率（）

符號說明(míng)：

試(shì)驗組(zǔ)活菌(jūn)數（CFU/mL）；

陽性對照(zhào)組活(huó)菌數（CFU/mL）1。

（二）判定標準(zhǔn)

產品(pǐn)類型(xíng)作(zuò)用時(shí)間(jiān)（min）有(yǒu)效氯濃(nóng)度(dù)（mg/L）殺(shā) 滅(miè)率(shuài)要求（%）

飲(yǐn)用(yòng)水消(xiāo)毒劑                             10                          500≥99.9

物(wù)體表麵(miàn)消(xiāo)毒劑                     5                                 800≥99.99

五(wǔ)，影(yǐng)響因素(sù)與優化策(cè)略

（一(yī)）關鍵因(yīn)素控製

因(yīn)素(sù)                            優化條件                                         效果

有(yǒu)效(xiào)氯濃度  500-1000 mg/L（根(gēn)據(jù)有(yǒu)機物(wù)調整）  殺滅(miè)率提升(shēng)至99.99%

作用(yòng)pH               6.5-7.5（中(zhōng)性(xìng)條(tiáo)件(jiàn)）                  HClO占比達80%以(yǐ)上(shàng)

溫(wēn)度20-25℃         溫度(dù)每(měi)升(shēng)高10℃，                           殺滅時間縮短一半(bàn)

（二）常見問(wèn)題(tí)解(jiě)決(jué)方(fāng)案

問(wèn)題現(xiàn)象                                 原因分析(xī)                                  解(jiě)決措(cuò)施

殺滅率偏(piān)低有 效(xiào)氯(lǜ)濃度不足或(huò)中和劑(jì)過(guò)量(liáng)重(zhòng)新標定(dìng)濃(nóng)度，調(tiáo)整中和(hé)劑(jì)用量至9 mL

菌落蔓延                            菌懸(xuán)液(yè)濃度(dù)過高                         增加稀(xī)釋梯(tī)度至10⁻⁴

中和劑失(shī)效(xiào)                  硫(liú)代(dài)liu酸鈉氧(yǎng)化(huà)                          使用新鮮配製的中和劑

六，質(zhì)量(liáng)控製與(yǔ)應用場(cháng)景(jǐng)

（一）質控(kòng)指(zhǐ)標

1.菌懸液濃度(dù)：1×10⁸±0.5×10⁸ CFU/mL；

2.中和劑(jì)有(yǒu)效性：中(zhōng)和後(hòu)殘留菌數≤10 CFU/mL2。

（二(èr)）典型(xíng)應用

1.飲(yǐn)用(yòng)水消毒(dú)：驗(yàn)證(zhèng)次(cì)氯酸鈣(gài)投加(jiā)後大腸杆菌(jūn)達(dá)標(biāo)（≤0 CFU/100 mL）；

2.醫療(liáo)環境表(biǎo)麵：物(wù)體表麵擦拭(shì)後殺(shā)滅(miè)率≥99.99%1。

關鍵(jiàn)詞：次(cì)氯酸(suān)鈣；大(dà)腸杆菌(jūn)；殺滅(miè)率(shuài)；懸(xuán)液定量試驗；GB/T 27952

參考文獻

[1] GB/T 27952-2020 消毒劑(jì)衛生要求[S].

[2] EN 1276 化學消毒(dú)劑殺菌(jūn)活性(xìng)評價(jià)[S].

[3] WHO 飲用水(shuǐ)消(xiāo)毒指南(nán)[S].