土壤微生(shēng)物多(duō)樣性檢(jiǎn)測
：從樣(yàng)品采集到群(qún)落(là) 

一，檢測(cè)標(biāo)準與方法選擇(zé)  

1.核(hé)心標準依(yī)據  

方(fāng)法(fǎ)類型標準號適(shì)用(yòng)場景(jǐng)檢(jiǎn)出限(xiàn)/分(fēn)辨率  

傳統(tǒng)培養(yǎng)法HJ1015-2019可培養微(wēi)生物(wù)計數10CFU/g  

高通(tōng)量(liáng)測序法EPAMethod16S微(wēi)生物群(qún)落(là)結構解(jiě)析(xī)種水平(píng)分辨(biàn)率（16SrRNA基(jī)因）  

宏基(jī)因(yīn)組(zǔ)測(cè)序(xù)GB/T38465-2020功能基因與代謝通路(lù)分析菌株(zhū)水平(píng)鑒(jiàn)定(dìng)  

2.方法對比與選(xuǎn)擇(zé)  

16SrRNA基(jī)因(yīn)測序(xù)
：性(xìng)價(jià)比高(gāo)
，適合大規模(mó)群落結(jié)構調查（推(tuī)薦(jiàn)V4區引物(wù)515F/806R）  

宏基因組(zǔ)測序
：揭示功能(néng)潛(qián)力(lì)
，但成(chéng)本較高(gāo)（建(jiàn)議(yì)用(yòng)於(yú)汙染場(cháng)地(dì)修復(fù)評估(gū)）  

二，樣(yàng)品(pǐn)采(cǎi)集與前(qián)處(chǔ)理(lǐ)關(guān)鍵(jiàn)技術  

1.無(wú)菌采(cǎi)樣流(liú)程(chéng)  

采(cǎi)樣工具
：滅(miè)菌(jūn)離心管（50mL），不鏽鋼(gāng)鏟(chǎn)（75%酒精擦拭(shì)消毒(dú)）  

采樣方(fāng)法
：五(wǔ)點(diǎn)混(hùn)合(hé)采(cǎi)樣(yàng)法
，每(měi)點采集(jí)0-10cm表層土(tǔ)
，混(hùn)合後過2mm篩(shāi)  

保(bǎo)存(cún)條件(jiàn)
：液(yè)氮速凍後-80℃保存(cún)（避(bì)免DNA降解）
，采樣(yàng)後24h內完成提取(qǔ)  

2.DNA提取優化(huà)  

試劑盒(hé)選擇
：PowerSoil®DNAIsolationKit（腐(fǔ)殖(zhí)質去(qù)除效(xiào)果佳）  

提(tí)取步(bù)驟
：  

1.0.5g土壤加入玻璃珠(zhū)
，渦旋振(zhèn)蕩30s破碎細(xì)胞(bāo)  

2.加(jiā)入C1溶(róng)液（抑(yì)製(zhì)腐殖(zhí)酸(suān)）
，65℃水浴10min  

3.磁珠(zhū)法(fǎ)純(chún)化(huà)
，洗脫體(tǐ)積(jī)50μL  

三，檢測技術與儀器條(tiáo)件  

1.16SrRNA基(jī)因測(cè)序(xù)    

PCR擴(kuò)增
：  

引(yǐn)物
：515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'）  

反應(yīng)體係
：2×TaqMasterMix25μL
，引物各(gè)1μL
，DNA模板5μL  

循環條(tiáo)件(jiàn)
：95℃（3min）→30×[95℃（30s）→55℃（30s）→72℃（45s）]  

測序(xù)平台(tái)
：IlluminaMiSeq（2×300bp雙端(duān)測序）   

2.數據分析(xī)流(liú)程(chéng)  

1.原始數(shù)據質(zhì)控
：Trimmomatic過濾低(dī)質量序(xù)列（Q30≥90%）  

2.OTU聚類(lèi)
：USEARCH（97%相似度(dù)）  

3.物(wù)種注釋
：SILVA數(shù)據(jù)庫(kù)比對（置信度≥80%）  

4.多樣(yàng)性(xìng)分析(xī)
：  

Alpha多樣(yàng)性
：Shannon指數(shù)（群落豐富度），Simpson指(zhǐ)數（群(qún)落(là)均匀度）  

Beta多樣性
：PCoA分析(xī)（基於Bray-Curtis距離）  

四(sì)，質量(liáng)控(kòng)製(zhì)與結(jié)果驗證(zhèng)  

1.關鍵(jiàn)質(zhì)控(kòng)指標(biāo)  

質控項目要(yào)求  

陰性對照無目(mù)標(biāo)條帶(dài)擴增(zēng)  

DNA濃度≥20ng/μL（Qubit定量）  

測序深(shēn)度(dù)≥30,000reads/sample  

2.結(jié)果(guǒ)驗(yàn)證(zhèng)方法(fǎ)  

qPCR定量
：16SrRNA基(jī)因拷貝數驗證(zhèng)（引(yǐn)物338F/518R）  

可培(péi)養(yǎng)驗證
：平板計(jì)數(shù)法（如(rú)石油(yóu)降解菌(jūn)數量與測序(xù)結果(guǒ)相關性分析）  

五，實戰案例(lì)
：石(shí)油(yóu)汙(wū)染(rǎn)場(cháng)地微生(shēng)物(wù)修(xiū)復評(píng)估(gū)  

1.背景(jǐng)  

某(mǒu)加(jiā)油(yóu)站(zhàn)泄(xiè)漏(lòu)場地
，TPH濃(nóng)度(dù)5200mg/kg
，修復(fù)前(qián)後(hòu)微(wēi)生物群(qún)落(là)變化(huà)分析(xī)  

2.關鍵結(jié)果  

指標修復前修復(fù)後(hòu)  

優勢菌門(mén)變形(xíng)菌(jūn)門(mén)（32%），放綫菌門(mén)（28%）變形菌(jūn)門（58%），擬(nǐ)杆(gān)菌門（22%）  

功(gōng)能(néng)基因烷烴降解基(jī)因(yīn)（alkB）豐度(dù)0.3‰alkB基因豐(fēng)度2.1‰  

Alpha多樣(yàng)性(xìng)Shannon指數(shù)4.2Shannon指數5.8  

3.結論  

微(wēi)生物(wù)群落結構顯著(zhù)優化(huà)
，降解(jiě)功能基因富集(jí)
，修(xiū)復效果xian著  

六，中科檢(jiǎn)測技(jì)術優勢  

1.全流程服務
：從采(cǎi)樣到(dào)數據分析一站(zhàn)式解決方(fāng)案(àn)  

2.平(píng)台(tái)配置(zhì)
：IlluminaNovaSeq6000（支持宏(hóng)基因組/宏轉錄組(zǔ)聯(lián)合(hé)分(fēn)析）  

3.數據庫支持
：自建汙染場地微生物參考(kǎo)數(shù)據庫（含(hán)10萬(wàn)+菌(jūn)株信(xìn)息）  

附錄
：常用(yòng)試劑(jì)與儀器清單  

測序(xù)引(yǐn)物合(hé)成（生工(gōng)生(shēng)物）  

高(gāo)通量(liáng)測序平(píng)台(tái)（IlluminaMiSeq）  

數(shù)據分析軟件（QIIME2，R語言(yán)vegan包）  

注
：本(běn)指(zhǐ)南適(shì)用(yòng)於(yú)汙染場地修(xiū)復(fù)評估，土壤健康(kāng)評價(jià)等場(cháng)景
，檢測(cè)周(zhōu)期(qī)建(jiàn)議(yì)7-10個工作(zuò)日(rì)（含測(cè)序(xù)與分析）
。